Elektrophorese in der Schule

(Verf.: H. Hübner)

 zurück

Aufstellen der Kammer

Die Elektrophorese-Kammer sollte tunlichst auf einem möglichst waagerechten Tisch aufgestellt werden, damit die Elektrodenräume nicht versehentlich überlaufen können, was unweigerlich zum Kurzschfuß führen würde. Schützen Sie die Kammer vor direktem Sonnenlicht, da sich dieses durch zu große Wärmeentwicklung negativ auf die Trennung auswirken kann.

Vorbereiten der Elektrophorese-Kammer

Es reichen etwa 250 ml Pufferlösung für eine Kammerfüllung aus. Es empfiehlt sich, den ph-Wert der Lösung mittels Indikatorpapier, das in jeder Sammlung vorhanden sein dürfte, zu überprüfen. Es sollte in jedem Falle zwischen pH 8,6 und pH 8,8 liegen.

• Gießen Sie in den linken und rechten Elektrodenraum die Pufferlösung ein und achten Sie darauf, daß der Puffer die Elektrodenkontakte gut bedeckt. Der Flüssigkeitsspiegel sollte aber auch nicht so hoch sein, daß der Mittelsteg der Kammer überspült wird. Kurzschlußgefahr!
• Beschicken Sie eine Kunststoffschale etwa 5 mm hoch mit Pufferlösung pH 8,6 und lassen Sie die Acetatstreifen anscließend flach auf die Pufferlösung fallen. Der Streifen darf erst untergetaucht werden, wenn er vollständig benetzt ist. Fassen Sie den Streifen anschließend mit der Folienpinzette und legen Sie ihn zwischen zwei Blatt Spezial-Saugpapier. Durch leichtes Darüberfahren mit dem Handrücken wird der Streifen von überschüssigem Puffer befreit.

Das Einlegen der Folien in die Kammer

Die Folien werden nun so in die Kammer eingelegt, daß links und rechts gleich lange Enden überstehen. Durch Umbiegen der Enden und gleichzeitiges Andrücken derselben auf die vorhandenen Zapfen, die sich durch die Folie drücken, wird dieselbe festgehalten. Achten Sie darauf, daß die Streifen dabei nicht durch hängen sondern straff gespannt sind.

• Tragen Sie mittels einer Auftrag-Kapillare oder Microliter-Transferpipette Ihre Probe auf. Verschließen Sie anschließend die Kammer mit dem Deckel mit Magnetverschluß, so daß der etwas vorstehende Magnet auf der Elektrodenseite der Kammer liegt. Erst jetzt den Strom einschalten

Nach einer bestimmten Laufzeit schaltet man das Gerät aus und nimmt die Folien heraus. Wurde mit Farbstoffgemisch gearbeitet, so braucht anschließend nicht gefärbt zu werden. Es gibt jedoch eine Reihe von Anwendungsbeispielen, z.B. Serum-Eiweiß~Auftrennungen, bei denen man nach Beendigung des Versuchs optisch nichts oder nur wenig wahrnehmen kann. In diesem Fall müssen die Streifen angefärbt werden. Man bringt dazu in eine Kunststoffschale etwa 5 mm hoch Färbelösung und füllt anschließend drei weitere Kunststoffschalen in gleicher Höhe mit Entfärbelösung. Ohne die Streifen abzutrocknen, werden sie nun in die Färbelösung gelegt. Nach etwa 5-6 Minuten nimmt man sie mit einer Folienpinzette heraus und legt sie nacheinander etwa 3-4 Minuten lang in drei Schalen mit Entfärbelösung, bis die Folien wieder weiß sind. Nach vollständiger Entfärbung werden die Foiien etwa 2 Minuten in das vorbereitete Transparenzbad gelegt. Anschließend werden die Folien auf die Glasplatte gelegt und leicht abgerollt. Schließlich werden die Folien samt der Platte auf das Trockengestell gelegt in den Trockenschrank gebracht und etwa 15-20 Minuten lang bei 95-100°C getrocknet.

• Achten Sie darauf, daß die Trockentemperatur eingehalten wird. Bei zu heißem Trockenschrank entstehen große Blasen auf der Folie, die dieselbe unbrauchbar machen

Erlernen der Färbetechnik und Behandlung der Acetat-Folien

• Zerteilen Sie eine Acetatfolie in zwei gleichlange Hälften. Tauchen Sie einen Finger in Milch oder Bier (Proteine) und drücken Sie den nicht zu feuchten Finger mit der Fingerbeere auf die Sorptionsschicht der Folie.

Anfärben der Proteine

• Beschicken Sie dafür zunächst eine der Kunststoffschalen etwa 5 mm hoch mit Färbelösung. FassenSie jetzt die Folienhälfte mit dem Fingerabdruck mit der Folienpinzette und legen Sie dieselbe in dieSchale mit Färbelösung. Dort verbleibt sie für mindestens 5 Minuten. Eine etwas längere Färbezeit schadet nicht.

Auswaschen des überschüssigen Farbstoffes

Man füllt zunächst 3 Kunststoffschalen etwa 5 mm hoch mit Entfärbelösung. Die gefärbte Folie wird jetzt nacheinander in die drei Kunststoffschalen gelegt, wobei sie in jeder Schale 3-4 Minuten verbleibt. ACHTUNG!! Das letzte Bad muß weitgehend farblos sein. Notfalls eine 4. Schale mit frischer Entfärbelösung verwenden.

Transparentmachen der Folien

Heizen Sie einen Trockenschrank auf 95°C auf. Stellen Sie anschließend die schwarze Transparenzbadwanne mit Deckel bereit und beschicken Sie dieselbe etwa 5 mm hoch mit Transparenzbadlösung. Säubern Sie eine Folienträgerplatte aus Glas gründlich mit Brennspiritus oder Alkohol und legen Sie dieselbe bereit. Nach vollständiger Entfärbung werden die Folien etwa 2 Minuten in das vorbereitete Transparenzbad gelegt. Anschließend werden die Folien auf die Glasplatte gelegt und leicht abgerollt.

Versuchsdurchführung

1. Stellen Sie die Elektrophoresekammer bereit und füllen Sie die beiden Elektrodenräume mit Pufferlösung nach Michaelis pH 8,6 Achten Sie dabei darauf, daß die Pufferlösung die Elektrodenkontakte gut umspült. Der Mittelsteg der Kammer darf nicht von Puffer überspült werden, Kurzschlußgefahr!!
2. Stellen Sie eine Kunststoffschale bereit und beschicken Sie diese mit Pufferlösung, etwa 5 mm hoch. Bereiten Sie eine weitere Schale mit Färbelösung vor und schließlich 3 weitere mit Entfärbelösung. Anschließend füllen Sie ebenfalls etwa 5 mm hoch Transparenzbadlösung in die schwarze Schale.
3. Füllen Sie je 50 µl Albumin- und Albumin IV -Lösung aus der Vorratsflasche mit einer Transferpipette in ein Eppendorfgefäß und beschriften Sie. In ein weiteres Gefäß füllen sie 50 µl Albumin.
4. Vermischen Sie nun Albumin mit 1 Tropfen Bromphenolblau. Dies ist die Refernzsubstanz.
5. Bereiten Sie 2 Acetatfolien vor und benetzen Sie dieselben wie im Vorversuch mit Pufferlösung. Spannen Sie die Folien anschließend in die Kammer.
6. Tragen Sie nun auf der Kathodenseite auf eine Folie 2 ml Rinderalbumingemisch mit der Glaskapillare auf und auf die andere Folie 2 ml Referenz-Proteinlösung - Bromphenolblaugemisch.
7. Legen Sie anschließend eine Spannung von 200 Volt an.

Nach etwa 15 Minuten ist der Versuch beendet. Bromphenolblau ist mit dem Albumin gewandert und zeigt die Wanderungsstrecke an. Von den anderen Fraktionen ist optisch noch nichts zu sehen.

Legen Sie jetzt alle Streifen in eine Schale mit Färbelösung und belassen sie dieselben etwa 5 Minuten lang darin. Anschließend alle Streifen nacheinander in Entfärbelösung bringen, die in drei Schalen vorbereitet wurde. Die Steifen in jeder Schale etwa 3-4 Minuten liegen lassen.

Das letzte Entfärbebad sollte so sauber wie möglich sein. Notfalls eine weitere Schale benutzen. Heizen Sie den Trockenschrank auf 95°C auf.

Bereiten Sie vier Folienträgerplatten vor. (Vorher gut mit Alkohol säubern.)

Nach vollständiger Entfärbung werden die Folien etwa 2 Minuten in das vorbereitete Transparenzbad gelegt. Anschließend werden die Folien auf die Glasplatte gelegt und leicht abgerollt. Schließlich werden die Trägerplatten in das Trockengestell gelegt und im Trockenschrank ca. 20 Minuten lang bei 95°C getrocknet.

Bei gelungenem Versuch sollten verschiedene Fraktionen sichtbar sein. Am weitesten wandert Albumin, gefolgt von Alpha-Globulin, Beta-Globulin und Gamma-Globulin. (Bei Verwndung von Blutserum als Untersuchungsprobe)

Eine quantitative Auswertung ist nur mit entsprechenden Geräten auf photometrischem Wege möglich. Diese Geräte sind jedoch für den Einsatz in der Schule zu aufwendig. Ein in der Nähe gelegenes Krankenhaus erklärt sich sicherlich bereit, eine derartige Auswertung für Sie durchzuführen.

Wenn das nicht möglich ist, muß man sich mit der qualitativen Auswertung, die im schulischen Bereich meistens ausreichend ist, begnügen.

Elektropherogramm Blut-Serum-Eiweiß Elektrophorese

Quelle: Mauer Didaktische Medien, Stofftrennung durch Elektrophorese, Bedienungsanleitung zum AMT-Elektrophorese- Set

 zurück