Elektrophorese

(Verf.: H. Hübner)

_Anleitung zur Elektrophorese für Schüler

Die Elektrophorese ist in der modernen biochemischen Analytik eine Standardmethode und dient der Trennung, Identifizierung und Gewinnung von geladenen (ionisierbaren) Molekülen. Solche Moleküle können Aminosäuren, Peptide und Proteine aber auch Nukleinsäuren, DNA-Fragmente und Glycoproteine sein. Die sich in einer Lösung befindlichen Moleküle wandern als Kationen (+) - geladen auf die Kathode und als Anionen (-) - geladen auf die Anode zu.

Die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld hängt ab von :

1. Feldstärke
2. Ladungsgröße des Moleküls
3. Größe und Form des Moleküls (Molmasse)
4. Trägermedium wie z.B. Papier, Celluloseacetat, Agararose-Gel, Polyacrymid-Gel
5. pH-Wert der Lösung / des Trägermediums

Den Zusammenhang von Wanderungsgeschwindigkeit, Ladung und Molekülgröße veranschaulicht folgendes Schema:

A. bei unterschiedlichen Ladungen, aber gleicher Größe wandern die hochgeladenen Teilchen besonders schnell B. bei gleicher Ladung und unterschiedlicher Größe wandern die kleinen Moleküle am schnellsten C. wenig geladene, große Moleküle wandern am langsamsten D. ist das Verhältnis von Ladung und Größe gleich,ist die Wanderungsgeschwindigkeit gleich

Heute ist besonders die Gelelektrophorese zur Trennung von Protein-Molekülen und DNA-Fragmenten in der Analytik und der biochemischen Forschung nicht mehr wegzudenken.

Ziel dieser Trennungsverfahren ist es eine möglichst große Auftrennung unter standardisierten Bedingungen zu erreichen. Hierfür sind einige Maßnahmen notwendig, die eine gleichmäßige Wanderung der Teilchen gewährleisten.

• Die Feldstärke wird durch Anlegen einer stabilisierten Gleichspannung erreicht, sie sollte 5-30 V/cm Trennweg nicht überschreiten, da die Trennkammer sonst gekühlt werden muß.
• Vom IEP hängt die Ladung des Protein-Moleküls ab. Bei Protein- bzw, Aminosäuregemischen arbeitet man zweckmäßigerweise bei einem konstanten pH-Wert. Dieses wird durch s.g. Pufferlösungen erreicht, die den pH-Wert einer Lösung während der Trennung stabil halten. Ist der pH > IEP so liegen Proteinanionen, bei pH < IEP Proteinkationen vor.
• Sollen nun Proteine aufgrund ihrer verschiedenen IEP-Werte getrennt werden so spricht man von einer Proteintrennung durch isoelektrische Fokussierung. Besonders Gele eignen sich als Trägermedium, da man hier sehr gut Zonen mit verschieden pH-Werten in die Laufstrecke einbringen kann, indem man die einzelnen pH-Zonen nacheinander gießt (s.u.). Man beginnt in der Nähe der Startlinie mit pH = 3 und ändert den pH-Wert in Schritten von einer Einheit auf pH = 8.

Natriumdodecylsulfat (NDS oder eng. SDS)

• Will man allerdings die Proteine nach der Molekülgröße trennen, so kann mit einem weiteren Trick das Verhältnis von Ladung , Molekülgröße und Form bei großen Proteinen einstellen. Durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (NDS oder eng. SDS) und Anlagerung an die Proteine werden diese in eine gestreckte Form und gleichzeitig in die Anionform umgewandelt. Es entstehen Proteinanionen, bei denen die Größe der Ladung proportional zu ihrer Molekülgröße ist. Bei dieser Methode bleibt der pH-Wert im gesamten Gel konstant. Die Eiweiße werden allerdings bei dieser Prozedur denaturiert, sie verlieren bis auf die Primärstruktur ihre räumlichen Strukturen. Läßt man nun ein Gemisch aus Proteinen mit bekannten Molmassen (Referenz / Längenstandard) mitlaufen, so kann durch Vergleich die Molmasse der einzelnen zu trennenden Proteine bestimmt werden.
• Als Trägermedium für die Trennung nimmt man heute meist Gele. Gele sind halbstarre Gebilde mit einer Maschenstruktur. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt von der Maschengröße bzw. von der Molekülgröße der Proteine ab. Bei Polyacrylamid-Gel kann diese Maschengröße ziemlich genau eingestellt werden, man spricht vom Vernetzungsgrad dieses Kunststoffes. Es wird aus zwei Komponenten, Pufferlösung und Wasser angemischt und vor dem Erstarren zwischen zwei Glasplatten gegossen. Damit die Startlinie einheitlich ist, formt man mit einem Kamm oben in das Gel Taschen, in die später die Proben eingebracht werden. Die Probenmenge kann sehr gering sein, schon 10 ng = 10^-9 g reichen aus.

	Trenngel für isoelektrische Fokussierung
	vertikale Elektrophoresekammer im Schnitt

• Nun stellt man die Gelplatte in eine mit Pufferlösung gefüllte Elektrophoresekammer, schließt den Deckel und trennt bei 120 V (Schulversuch)- 300 V ca, 1 - 2 h lang.
• Im Anschluß an die Trennung wird die Gelschicht abgelöst und zunächst fixiert, anschließend färbt man mit besonderen Farbstoffen die Proteinfraktionen an ,um sie sichtbar zu machen. Alternativ kann man die Proteine radioaktiv markieren und in diesem Fall wird dann über das Gel ein Röntgenfilm gelegt, der dann die Banden der einzelnen Proteinfraktionen nach dem Entwickeln zeigt. Dieses Methode wird heute im großen Stil in Analyse-Laboratorien zum Teil automatisch angewendet.
• Da bei einer Elektrophorese immer ein Gemisch aus entweder bekannten Proteinen oder Proteinen bekannter Molmasse mitlaufen sollte, kann dieses Verfahren zur Identifizierung dienen. Wenn bei der Gelelektrophorese die Molekülmasse das entscheidene Trennkriterium ist, laufen kleine Proteine schnell, große hingegen langsam.
  Bei der isoelektrische Fokussierung hingegen wandern die Proteine am weitesten, deren IEP am deutlichsten im basischen Bereich liegt.
  Man kann Gemische sowohl anhand von Zahl und Lage der Banden unterscheiden, als auch einzelne Banden mit Hilfe der Referenzsubstanzen identifizieren.

A,B,C,D sind verschiedene Proteingemische. E ist das Referenzgemisch . Das Pherogramm zeigt: Die Proteingemische sind nicht identisch, da Zahl und Lage der Banden nicht übereinstimmen. Nur die Gemische A und D enthalten Proteine mit bekannten Molmassen und sind zu identifizieren.

Quellen :

• B. Behrens Handbuch Gelelektrophorese, Phywe, Göttingen 1993
• Chemie heute Sek II , Schroedel Verlag, Hannover 1992
• H.Aebi, Einführung in die praktische Biochemie, Karger Verlag, Basel 1971
• M.Engerer, M.Lederer, CHAMBA, Klett Schulbuchverlag Stuttgart 1990

_Anleitung zur Elektrophorese für Schüler