AIDSfall Martina N: naturwissenschaftliche Hintergründe (Verf.: B. A. Roschke)

Das Lösungsmuster zu den Hilfsfragen ist bewusst nicht in der Form eines Zeitungsartikels gehalten, da dann die Zuordnung der fachlichen Inhalte zu den einzelnen Fragestellungen einfacher ist:

Eine Infektion im Mutterleib ist möglich, da das Virus hauptsächlich durch Blut-zu-Blut-Kontakte übertragen wird. In der Schwangerschaft besteht über die Plazenta ein sehr naher Kontakt zwischen dem mütterlichen und kindlichen Blutkreislauf, so dass das Virus hier in den kindlichen Körper gelangen kann. Auch während des Geburtsvorgangs kann das Kind infiziert werden.

Laut Literaturangabe (Text der Bundeszentrale für gesundheitl. Aufklärung) "kommt es bei 15-30 % der Kinder HIV-infizierter Mütter zu einer prä- oder perinatalen Übertragung des Virus".

Laut einem neueren Fernsehbericht in N3-Visite vom Okt. 1998 liegt das Hauptrisiko der Infektion während der Geburt, wo durch bestimmte Stoffe im Fruchtwasser die Infektionsbereitschaft des kindlichen Organismus steigt. Internationale Untersuchungen zeigten, daß dieses Infektionsrisiko durch Kaiserschnittentbindungen vor Einsetzen der Wehen und nach vorheriger Behandlung der Mutter mit antiviralen Medikamenten auf wenige % gesenkt werden konnte. Zum damaligen Zeitpunkt war also für das Baby Martina die Möglichkeit einer HIV-Infektion zwar gegeben, aber keineswegs sicher.

Der Western-Blot-Test weist nicht das Virus im Blut des Kindes direkt nach, sondern nur, ob Antikörper gegen das Virus im Blut vorhanden sind.

Diese Antikörper werden durch Plasmazellen des Immunsystems als Antwort auf einen Kontakt mit dem Krankheitserreger gebildet. Sie befinden sich im Blutplasma (o.Blutserum). Um eine Verwechslung der Antikörper gegen das HIV mit anderen Antikörpern auszuschließen, ist dieser Test so aufgebaut, daß er sehr spezifisch nur auf die HIV-Antikörper reagiert. Mit der PCR-Methode wird ein ganz bestimmtes DNA-Stück, nämlich die DNA des Virus, die sich in die DNA der Immunzellen eingebaut hat und nur in sehr kleinen Mengen vorhanden ist, millionenfach vervielfältigt und kann dadurch nachgewiesen, bzw. analysiert werden.

Bei beiden Verfahren wird die Methode der Gelelektrophorese angewandt. Die Unterschiede liegen darin, daß die Gelelektrophorese beim Western-Blot-Test bei der Herstellung des genormten Teststreifens zur Anwendung kommt, bei der DNA-Analyse erst bei der Trennung der PCR-Produkte. Wie die Abbildungen des Virus zeigen, enthält seine Hülle mehrere Proteine und Glykoproteine. Laut Infoblatt "Immunbiologie" reagiert der Körper gegen körperfremde Makromoleküle mit der Bildung von unterschiedlichen Antikörpern gegen diese "antigenen Determinanten". Die Antikörper gegen die verschiedenen ganz spezifischen Proteine des HIV werden nun mit dem Western-Blot-Test nachgewiesen.

Es wird dazu ein Teststreifen mit den Virusproteinen hergestellt. Dieser wird mit dem Serum des Getesteten zusammengebracht, sind in diesem Serum Antikörper gegen die Viruseiweiße vorhanden, können diese mittels einer 2.Antikörperlösung, eines Enzyms und eines Farbstoffs (Sandwichbildung) sichtbar gemacht werden. Die gefärbten Banden auf dem Teststreifen geben dann ein für den HIV spezifisches Muster wieder: Als sicherer Nachweis gilt, "wenn Antikörper gegen die Virusproteine p 24 und gp 41 oder gegen p 24 und gp 120 gefunden werden ".

In der Elektrophoresekammer wird durch Anlegen eines Gleichstromes ein elektrisches Feld erzeugt, in welchem geladene Teilchen zum jeweils entgegengesetzten Pol wandern können. Diese Teilchen wandern je nach Ladung und Molekülgröße unterschiedlich weit, so können die verschiedenen Teilchen eines Gemisches getrennt werden und bilden "Banden", wodurch sie identifiziert werden.

Diese "Teilchen" sind beim "Western-Blot-Test" die Proteine der HI-Virus-Hülle. Proteine sind bei bestimmten pH-Werten (IEP)Zwitterionen, die sich im elektrischen Feld nicht bewegen, sondern nur ausrichten können. Diese Proteine können folgendermaßen aufgeladen werden.:

• Die einheitliche Ladung kann z.B. an den terminalen Aminosäuren erfolgen durch Protonierung (H⁺-Anlagerung) an COO^- oder durch Abspaltung von H⁺ aus einer NH₃⁺-Gruppe, oder ähnliche Vorgänge an den Seitenketten. Die nun vorliegenden Anionen und. Kationen können im elektrischen Feld wandern.
• Durch Behandlung mit SDS werden die Proteine alle denaturiert, gestreckt und negativ geladen. Die Trennung erfolgt nun allein nach der Teilchengröße: P24 ist ein wesentlich kleineres Protein als gp 120, es kann sich schneller im elektrischen Feld bewegen .Die getrennten Virusproteine bilden nach der Elektrophorese ein für den HIV typisches Bandenmuster, welches auf eine Folie übertragen und in Streifen geschnitten wird.

Trotz der Spezifität des Western-Blot-Tests kann das Testergebnis nicht als klarer Hinweis auf eine HIV-Infektion des Kindes gewertet werden, da Antikörper der Mutter die Plazenta durchdringen und bis zu 2 Jahren im Blut des Kindes vorhanden sein können.

Mit der PCR-Methode wird ein ganz bestimmtes DNA-Stück, das nur in sehr kleinen Mengen vorhanden ist, millionenfach vervielfältigt und kann dadurch nachgewiesen, bzw. analysiert werden. Konkret: HIV-DNA wird mittels spezieller Startsequenzen (Primer) in der Gesamt-DNA weißer Blutzellen erkannt und selektiv vervielfältigt.

Dabei macht man sich die Eigenschaft der DNA zunutze, bei hohen Temperaturen (90° C) zu denaturieren, d.h. die Wasserstoffbrücken zwischen den Einzelsträngen zu lösen. Wird die Temperatur wieder gesenkt, verbinden sich die Einzelstränge wieder mit den zu ihnen komplementär passenden Primern. Bei geeigneter Temperatur kann dann das Enzym Taq-DNA-Polymerase vom Ende der Primer ausgehend den komplementären DNA-Strang synthetisieren. Durch ständige Wiederholung der Vorgänge: Trennen ,koppeln und vermehren wird so das virale Erbgut vervielfältigt. Da die Taq-Polymerase hitzestabil ist, kann dies ohne Neuzugabe von Enzym in einem Versuchsansatz automatisch über viele Zyklen durch einen Maschine durchgeführt werden.

Bei der Elektrophorese wandern DNA-Fragmente in Richtung des Plus-Pols, denn sie sind negativ geladen (durch die Phosphatgruppen). Ihre Wanderungsgeschwindigkeit (bei einheitlicher Feldstärke) hängt nur von der Fragment-Länge ab. Um die Fragmente zu identifizieren, wird auf dem gleichen Gel ein sog. Längenstandard angesetzt: Die DNA-Probe enthält verschiedene Fragmente bekannter Länge, die sich dann auch nach ihrer Wanderungsgeschwindigkeit auftrennen. Im Vergleich dazu werden DNA-Proben mit und ohne Virus-DNA als "Positiv-" und "Negativ"-Kontrolle eingebracht, die nach Ablauf der Elektrophorese charakteristische Banden im Vergleich zum Längenstandard zeigen. In weitere Taschen des Elektrophoresegels können nun die PCR-Produkte der Patienten eingebracht werden und anhand des Vergleichs mit dem Längenstandard und den Kontrollen ausgewertet werden.

Vorteile der DNA-Analyse: Die Virus-DNA kann damit direkt nachgewiesen werden, das PCR-Verfahren ermöglicht eine Identifizierung auch sehr geringer Virusmengen. Die Unsicherheit bei der Unterscheidung kindlicher und mütterlicher Antikörper fällt dadurch weg.

Die Möglichkeit, daß bei der konkreten Probenbearbeitung Fehler gemacht werden, ist hierbei größer, da das Verfahren komplizierter ist.

• Wahrscheinlicher als eine falsch-negatives Ergebnis ist in dem Labor ein falsch positives Ergebnis, da auch minimale DNA-Spuren vervielfältigt werden, die zum Beispiel aus anderen Proben in die Reaktionsgefäße verschleppt werden könnten, dies sollte aber durch Vorsichtsmaßnahmen vermieden werden können.
• Bei den vielen Arbeitsschritten von der Aufbereitung der Blutprobe über die PCR bis zur Elektrophorese können Flüchtigkeitsfehler beiTeilschritten ein korrektes Ergebnis unmöglich machen.

Folgende Durchführungsfehler sind außerdem denkbar:

• Eine zu starke Erhöhung der Spannung bewirkt nach der Beziehung E= U/d (siehe Infoblatt elektr. Feld) eine höhere Feldstärke und daher eine größere Wanderungsgeschwindigkeit und somit Trennung der DNA-Fragmente, daher wird das Bandenmuster verschoben sein. Die erhöhte Spannung könnte außerdem eine Überhitzung des Gels bewirken.
• Durch eine falsche Pufferlösung (zB. pH 4 statt ph 8) wird die Ladung der DNA-Fragmente verändert, die DNA könnte in kleinere Bruchstücke zerfallen, auf jeden Fall wird die Lage der Banden verändert.
• Auf jeden Fall hätte dem verantwortlichen Mitarbeiter eine veränderte Lage der Banden im Längenstandard sowie in den Kontrollen auffallen müssen, was eine Bewertung der Patientenproben in Frage stellt. Ein seriös arbeitendes Labor müßte sich gegen Fehler durch 2-3fach-Bestimmung absichern.
• Die falsch-negativ-Bestimmung muß nicht unbedingt auf einen Fehler des Labors zurückzuführen sein ,es könnte auch der sehr seltene Fall vorliegen, daß in Martinas Blutprobe kein weißes Blutkörperchen mit Virus-DNA enthalten war.